尊龙凯时的mRNA技术作为一种新兴的生物技术，拥有极大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，这一技术为疾病的预防与治疗提供了前所未有的视角。然而，mRNA技术的发展过程中并非一路顺风，其中最大的挑战之一是副产物双链RNA（dsRNA）的产生。dsRNA作为一种免疫刺激分子，能够导致机体免疫反应的发生，这直接影响了mRNA的安全性与有效性。因此，减少dsRNA的形成成为了mRNA技术领域亟需解决的关键问题。

传统的解决方案通常依赖复杂的纯化工艺，但此方法成本高、效率低，且难以完全去除微量的dsRNA。在mRNA体外转录（IVT）中，T7RNA聚合酶（T7RNAP）的天然活性（如末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性）被认为是dsRNA形成的主要原因。因此，通过定向进化或理性设计改造T7RNAP，成为全球科研团队争相探索的热点。

在2024年3月3日，我们的研究团队在FEBS Journal发表了题为《Engineering T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities》的论文。团队成功通过工程化手段改造T7RNAP，显著降低了体外转录过程中dsRNA的生成（仅为野生型的18%），同时大幅提升了mRNA合成的整体效率与质量，进一步推动了基因治疗与疫苗开发领域的快速发展。

我们创新性地结合了定向进化与半理性设计的方法，成功筛选出多个高效、低毒的T7RNAP突变体。这些突变体在减少dsRNA形成方面表现优异。我们构建了随机突变库，并设计出一种可实时监测液滴内RNA产物完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，利用荧光激活液滴分选（FADS）技术进行了超高通量筛选。最终筛选出关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T）时，其产生的dsRNA含量显著低于野生型。

同时，通过半理性设计，我们构建了十个单点饱和突变库，并且通过微孔板筛选技术识别有益突变体。在筛选过程中，微孔板采用了双探针技术，以增加5’-end探针获取 RNA 产量的数据。经过筛选超过1000个突变体后，我们找到了关键候选突变体Mut11（K180E）和Mut14（A70Q），它们的dsRNA含量显著低于野生型，同时未影响转录效率。

为了进一步优化突变体，我们针对上述突变位点构建了DNA重组文库，通过微孔板筛选，最终获得组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。实验结果显示，M17的dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中仅为0.007 ng/μg。这一结果不仅在体外实验中得到了验证，在细胞实验中也表现出显著的免疫原性降低和蛋白翻译效率提升。

我们将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，最优突变体M11产物引发的干扰素β（IFN-β）mRNA和蛋白表达量分别仅为野生型的97%和1293 pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数量显著增加，且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA能够有效解除PKR介导的翻译抑制，从而释放mRNA治疗的潜力。

为深入了解突变体降低dsRNA的作用机制，我们通过计算机模拟与功能实验揭示，突变体通过降低RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性而减少了dsRNA的形成。这一发现为未来进一步优化T7RNAP提供了重要理论依据。

本研究为T7RNAP的改造提供了新的方法与思路，也为mRNA技术的发展注入了新活力。通过减少dsRNA的生成，提升了mRNA的质量和安全性。凭借这一研究成果，尊龙凯时成功推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级别T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7 RNA Polymerase GMP-grade (low dsRNA, 250 U/μL)）。该产品在mRNA疫苗、mRNA药物等领域展现出广泛的应用潜力，有望进一步推动mRNA技术的快速发展，为生物医学领域带来更多可能性。

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